背景

隨著源自goose/Guangdong (Gs/GD)系的 2.3.4.4b 支系在全球范圍內(nèi)的傳播，高致病性禽流感病毒（HPAIV）已成為對家禽業(yè)和野生動物多樣性構成嚴重威脅的重要病原體。這類病毒能夠感染多種鳥類，因此極有可能促進其在全球野鳥群體間的廣泛傳播。研究顯示，與雞相比，鴨子感染該病毒所需的感染劑量和致死劑量更低，但臨床癥狀卻極輕微。由此，鴨類在病毒于養(yǎng)殖系統(tǒng)內(nèi)以及不同養(yǎng)殖場之間的傳播中扮演著關鍵角色。
感染的鳥類會將病毒排入環(huán)境中，病毒的傳播可通過直接或間接接觸（包括空氣傳播）發(fā)生，從而引發(fā)禽群內(nèi)部及禽群之間的感染。此外，由于病毒可在環(huán)境中存活，環(huán)境采樣有望成為禽流感監(jiān)測的替代方案，取代對禽鳥的拭子采樣。這種方法對禽鳥無創(chuàng)、效率更高，也不需要專業(yè)人員操作。因此，F(xiàn)ilaire 團隊開展了對感染 2.3.4.4b 支系 H5N8 高致病性禽流感病毒的鴨群的環(huán)境污染擴散研究。他們使用傳統(tǒng)檢測方法和空氣監(jiān)測方法（得益于 Coriolis Compact 生物氣溶膠采樣器），比較了兩種采樣手段的檢測效果。

實驗材料

Coriolis Compact（型號：P002055-CORC0-A.0），采樣時間：20 分鐘，流量：50 L/min
兩株 2.3.4.4b 支goose/Guangdong (Gs/GD) H5N8 HPAIV 病毒
ID Gene Mag Fast Extraction Kit 磁珠核酸提取試劑盒（Innovative Diagnostics, Grabel, 法國）
KingFisher 96 自動磁珠提取儀（Thermo Fisher, 美國加州卡爾斯巴德）
Influenza H5/H7 Triplex Kit（Innovative Diagnostics, Grabel, 法國）

實驗方案

?兩種病毒均通過向 9–11日齡特定病原體陰性（SPF）雞胚的尿囊腔注射進行增殖與定量。隨后，將鴨隨機分為兩個房間飼養(yǎng)，飼料與飲水自由攝取。經(jīng)過一周適應期后，每個房間的 10 只鴨經(jīng)鼻腔內(nèi)接種 10? EID?? 的 H5N8/2017 或 H5N8/2020 株病毒。接種后一天，在每個房間中各引入 6 只未接種鴨，用以評估病毒接觸傳播能力。 為研究病毒排出情況，依據(jù)官方 HPAIV 檢測協(xié)議收集口咽拭子（OP）和泄殖腔拭子（CL）。環(huán)境污染通過在鴨舍中布置 Coriolis Compact 生物氣溶膠采樣器進行監(jiān)測。采集樣品于 4 °C 保存最多兩天后轉移至 ?80 °C 凍存。 拭子樣品置于含 500 μL 磷酸鹽緩沖液（PBS）的 1.5 mL 離心管中，渦旋混勻 10–15 秒；Coriolis Compact 收集的氣溶膠樣品以 1 mL PBS 重懸，并渦旋混勻 5–15 秒以釋放收集管壁上的顆粒，必要時再進行移液操作。所有樣品均在 IRTA-CReSA ?80 °C 凍存，并于圖盧茲國家獸醫(yī)學院 BSL-3 實驗室檢測。 總 RNA 使用 ID Gene Mag Fast Extraction Kit 及 KingFisher 96 自動系統(tǒng)提取。H5 型 AIV RNA 檢測采用 Influenza H5/H7 Triplex Kit，通過一步法實時定量反轉錄 PCR（rRT-qPCR）進行，共 40 個擴增循環(huán)。未檢出病毒 RNA 的樣品視為陰性。 該實驗由法國圖盧茲 IHAP 研究單元與西班牙巴塞羅那 CReSA-IRTA 聯(lián)合開展，選用法國 2017 年和 2020 年暴發(fā)疫情中的兩株 HPAIV，以比較其生物學特性差異。

?實驗設計時間線：比較傳統(tǒng)官方 HPAIV 檢測方法（拭子采樣）與環(huán)境氣溶膠采樣（Coriolis Compact）在病毒 RNA 檢測性能上的差異。

實驗結果

?結果顯示：通過官方 HPAIV 檢測方法（OP、CL 拭子）與 Coriolis Compact 環(huán)境空氣采樣所得的病毒 RNA 傳播動態(tài)趨勢一致。 ?圖 2A、2B：兩種病毒株在 OP 與 CL 拭子檢測中的病毒 RNA 負載變化。紅、藍實線分別代表接種 H5N8/2017 和 H5N8/2020 的鴨群；紅、藍虛線代表接觸組。 ?圖 2C：兩種病毒株在鴨舍環(huán)境空氣中（Coriolis Compact 采樣）的病毒 RNA 負載變化。 對于兩種拭子采樣方式，同一病毒株的接種鴨與接觸鴨的病毒 RNA 含量隨時間變化趨勢相似（圖 2A、2B）。病毒 RNA 負載在感染后約第 4 天（dpi）達到峰值，之后逐漸下降至第 14 天；無論通過 OP 拭子還是 Coriolis Compact 采樣，均呈現(xiàn)這一規(guī)律（圖 2）。 對于 CL 拭子檢測，H5N8/2020 株在 2–6 dpi 間病毒 RNA 水平相對穩(wěn)定，10–14 dpi 逐漸下降；而 H5N8/2017 株的變化模式更接近 OP 拭子與 Coriolis Compact 采樣的趨勢（圖 2B）。盡管兩種病毒株存在一定的生物學差異，但三種采樣方法檢測到的病毒排毒總體趨勢一致（圖 2）。

結論

Filaire 團隊的研究表明，在感染或未感染 HPAIV 的鴨群圈舍中，病毒感染與擴散的模式在采用標準生物采樣（拭子）或使用 Coriolis Compact 生物氣溶膠采樣器進行環(huán)境檢測時基本一致。 ?Coriolis Compact 生物氣溶膠采樣器 提供了一種符合人體工學、可靠的替代方案，可替代成本更高且需專業(yè)人員操作的拭子采樣。該方法具有快速、操作簡便、無創(chuàng)、經(jīng)濟高效且準確等優(yōu)勢，為農(nóng)場內(nèi)禽流感病毒的主動檢測與監(jiān)測提供了理想手段，相較傳統(tǒng)拭子檢測更具實用價值。

來源：Filaire, F., Bertran, K., Gaide, N. et al. Viral shedding and environmental dispersion of two clade 2.3.4.4b H5 high pathogenicity avian influenza viruses in experimentally infected mule ducks: implications for environmental sampling. Vet Res 55, 100 (2024). https://doi.org/10.1186/s13567-024-01357-z